Revista de Medicina de Estudiantes del Sur

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN | VOLUMEN 9, NÚMERO 1, ABRIL 2021

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El autor declara no tener conflictos de interés.

Conflictos
de interés.

Carolina Catril Moncada.

caro.catril.m@gmail.com

Correspondencia

Efectos del Ozono en la Regeneración Nerviosa en Ratas. Una Revisión Sistemática.

Abdías Cofré,1 Gabriela Cofré,2 Elías Figueroa.3 

(1) Facultad de Medicina, Universidad de la Frontera, Temuco, Chile. 
(2) Instituto de Odontoestomatología. Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. 
(3) Departamento de Ciencias Químicas y Biológicas. Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile. 

RESUMEN

ANTECEDENTES: Agentes antioxidantes como el ozono se han utilizado previamente para tratar lesiones nerviosas. Este, en particular, presenta potencial como terapia neuroregenerativa no invasiva debido a su mecanismo de acción. Sin embargo, existen pocos estudios experimentales sobre ozonoterapia y su efecto sobre regeneración nerviosa periférica.

OBJETIVO: Evaluar los efectos de la ozonoterapia (TO) sobre lesiones nerviosas en ratas.

MÉTODO: Para esta revisión sistemática, se consideraron estudios publicados entre los años 2015 y el 15 de mayo del 2020 con las palabras clave Ozone AND «nerve regeneration”, obtenidos de bases de datos como: Medline (Pubmed), SCOPUS, Web of Science, EMBASE, Clinical Key y Journal of Neurosurgery. La calidad metodológica se evaluó mediante la pauta ARRIVE.

RESULTADOS: De 38 resultados, se incluyeron 7 artículos de acuerdo a los criterios de inclusión. Estos comprenden entre 14 y 100 ratas como sujetos de prueba, en donde se evaluaron los efectos del ozono en la regeneración nerviosa dentro de un periodo de 7 y 90 días. Los siete estudios arrojaron resultados positivos sobre el tratamiento de lesiones nerviosas con ozono, dos estudios indicaron resultados superiores al utilizar ozono y metilprednisolona combinados.

DISCUSIÓN: Si bien la evidencia recabada fue limitada, la TO demostró capacidades neuroprotectoras y promotoras de regeneración nerviosa al contribuir con la creación de un microambiente favorable para este proceso, capeando los efectos del estrés oxidativo sobre el tejido. La TO complementada con metilprednisolona fue superior a la TO por sí sola, observándose una mayor respuesta antiinflamatoria y antioxidante, con menor índice de degeneración. Esto sugiere un posible potenciamiento de las cualidades neuroprotectoras de ambos tratamientos. Estos hallazgos indican la posibilidad de desarrollar terapias de regeneración nerviosa basadas en ozono en el futuro.

PALABRAS CLAVE: ozono; metilprednisolona; regeneración nerviosa; agentes neuroprotectores

INTRODUCCIÓN

A pesar de que el sistema nervioso periférico (SNP) tiene una capacidad intrínseca de reparación y regeneración1,2, cuando se produce una lesión nerviosa, se genera estrés oxidativo como resultado de la producción de radicales libres de oxígeno (ROS)3 que influyen en la regeneración nerviosa a través de la inducción, disfunción y muerte celular, degeneración axonal y neurodegeneración4, por lo que estudios in vivo han sugerido que la administración de sustancias antioxidantes podría reducir los niveles de ROS mediante la estimulación de mediadores5.

Con el avance de la tecnología y evolución de las técnicas convencionales de regeneración nerviosa, se ha dado paso al uso de prácticas alternativas no invasivas como la terapia de ozono (O3)6, el cual resulta ser un poderoso oxidante con una vida media corta de 20 minutos a temperatura normal, descomponiéndose y dispersándose fácilmente en agua. El O3 puede restringir los factores celulares inflamatorios, activar la ciclooxigenasa y disminuir la reacción de estrés a la oxidación histiocítica, aumentando la capacidad celular de resistir la oxidación y los radicales libres. También puede eliminar los radicales libres resultantes de la inflamación crónica, puede servir como analgésico y antiinflamatorio5,7.

Este elemento se ha utilizado y estudiado en medicina y odontología durante mucho tiempo, aplicándose para alteración de metabolismo de tumores, exterminación de patógenos, tratamiento de enfermedades oculares, ortopédicas, dermatológicas, infecciones, cirugía oral, maxilofacial e implantología8-10. Sin embargo, el terreno de la neuro-regeneración aún se mantiene bajo estudio, sobre todo en cabeza y cuello. Es por esto que se vuelve esencial encontrar una terapia no invasiva efectiva que le devuelva al paciente su calidad de vida, mitigando el dolor o los síntomas del daño nervioso. 

El objetivo de esta revisión es analizar el efecto de la ozonoterapia sobre la regeneración nerviosa periférica en ratas, usando como guía la siguiente pregunta clínica: En caso de daño a los nervios periféricos, el uso de terapias regenerativas en base a ozono comparadas con grupos control ¿Resulta una opción viable y eficaz para la regeneración nerviosa?

MATERIALES Y MÉTODOS

Para efectos de esta revisión sistemática, se consideraron artículos que comprendían estudios in vivo publicados durante los últimos 5 años en idioma inglés mediante el acceso a bases de datos como Medline (Pubmed), SCOPUS, Web of Science, EMBASE, Clinical Key y Journal of Neurosurgery (JNS).

La búsqueda se llevó a cabo de forma independiente y duplicada por dos revisores (A.C y G.C) entre los días 15 de junio y 29 de junio del 2020 bajo la estrategia: Ozone AND «nerve regeneration”, ambos como términos MeSH unidos por el operador boleano AND, aplicando un filtro de 5 años, a excepción de la plataforma Clinical Key en donde adicionalmente se añadió el filtro de artículos de revistas. Además, en la búsqueda efectuada en el JNS, sólo se hizo uso del término “Ozone” sin filtros.

Se excluyeron aquellos artículos que no presentaron la palabra Ozone u Ozone Therapy en el título y aquellos que no lo abordaron como técnica regenerativa.

En el proceso de selección participaron dos revisores y constó de 5 pasos. En primer lugar, se descartaron los artículos que se encontraban repetidos, seguido de la eliminación de artículos de acuerdo a la lectura de títulos, de abstracts y de texto completo que no considerarán a la terapia de ozono o que no abordarán la misma con fines neuroregenerativos.

Por último, cada artículo restante se evaluó en cuanto a calidad metodológica según la pauta de chequeo ARRIVE exclusiva para la descripción de la investigación en animales.

Las variables consideradas en este estudio se dividieron de la siguiente forma para su medición:

Terapia de regeneración nerviosa en base a ozono como variable independiente definida como la aplicación de ozono de forma intraperitoneal y extraoral en sujeto de prueba.

Y la regeneración nerviosa como variable dependiente descrita como la recuperación de la funcionalidad y citoarquitectura nerviosa.

El nivel de riesgo de sesgo y validez de cada artículo se evaluó aplicando la pauta ARRIVE para escritura de ensayos clínicos durante la selección de estudios, siendo eliminados aquellos con deficiente metodología.

No se realizaron análisis adicionales a parte de los ya descritos.

RESULTADOS

De la búsqueda en las distintas bases de datos se obtuvieron 38 artículos, disminuyendo a 25 luego del descarte por duplicación. Posteriormente, se eliminaron por título 16 artículos obteniendo un total de 9 artículos. Ninguno de ellos fue eliminado por lectura de abstract pero si efectuó el descarte de 1 por lectura de texto completo. Finalmente se analizaron los 8 artículos restantes mediante la pauta ARRIVE, resultando en la eliminación de 1 artículo más. En total se utilizaron 7 artículos para el análisis del tema en cuestión [Figura 1].

 

En la Figura 2 se expresa gráficamente la revisión en base a la pauta ARRIVE de los 7 artículos seleccionados, considerándolos adecuados para el desarrollo de esta investigación por cumplir ampliamente con los ítems mencionados en la guía, haciendo posible su reproducción y garantizando la validez de sus resultados.

 

Todos los estudios fueron realizados en animales con el objetivo de medir los posibles beneficios de la aplicación de la terapia basada en ozono en la regeneración nerviosa. Las características generales de estos artículos fueron resumidas en la tabla 1.

Los aspectos relevantes de la metodología y resultados relacionados a la terapia de ozono de los estudios considerados se encuentran resumidos en la tabla 2.

  • Figura 1
  • Figura 2
  • Tabla 1

 Figura 1. Diagrama de flujo pauta PRISMA: Proceso de selección de los estudios incluidos.

 Figura 2. Análisis de estudios seleccionados en base a pauta ARRIVE para estudios realizados en animales.

 Tabla 1. Aspectos generales artículos seleccionados.

 

DISCUSIÓN

El propósito de este trabajo es realizar una revisión sistemática de estudios in vivo sobre el uso de terapia de ozono en el contexto de regeneración nerviosa periférica.

El daño nervioso periférico es una condición común, de variada etiología y severidad. En la actualidad, si bien existen tratamientos que contribuyen a la recuperación y rehabilitación, pueden no ser lo suficientemente confiables o no asegurar una regeneración completa y adecuada11.

Posterior a la lesión se produce un proceso degenerativo en el extremo distal de la fibra nerviosa, denominado como degeneración Walleriana. El extremo proximal de la fibra nerviosa es capaz de regenerarse y reestablecer su función. Las lesiones nerviosas periféricas se caracterizan por la presencia de desmielinización, degeneración, edema, y formación de tejido cicatricial o fibroso12. Asimismo, el proceso regenerativo funcional de las fibras nerviosas se ve afectado e inhibido por diversos factores, entre los que destacan la distancia desde el sitio del daño, tipo de lesión, la edad del individuo, inflamación postraumática y estrés oxidativo13-15.

En este marco la presencia de un ambiente permisivo es deseable y beneficioso para estimular y promover la regeneración. Es por esta razón que la búsqueda de terapias alternativas o complementarias a tratamientos estándar se vuelve importante.

Basados en los resultados entregados por la búsqueda realizada, se observa una cantidad muy limitada de literatura relacionada, con sólo 7 resultados en los últimos 5 años que responden la pregunta de investigación planteada, desde 2020. La poca literatura previa disponible puede deberse a que el uso de la terapia de ozono con fines neuro-regenerativos es un concepto reciente. 

Ozbay5 menciona un umbral de estimulación promedio de 0.064 mA a los 30 días en células tratadas con terapia de ozono frente al umbral de estimulación promedio de 0.084 mA en el grupo control a los mismos 30 días; indicando una mejoría funcional en las células tratadas con TO. Estipulando, además, que la mejoría observada en el grupo control puede ser atribuida a recuperación nerviosa espontánea. Luego de los 30 días, se encontraron diferencias significativas en la fibrosis tisular, congestión vascular y la macrovacuolización, siendo estas menores en el grupo intervenido. Lo anterior es significativo para la correcta regeneración del nervio, disminuyendo la inflamación, edema y tejido cicatricial. Este último ha demostrado ser negativo para la correcta regeneración de tejido nervioso, promoviendo la adhesión de las fibras nerviosas a tejidos periféricos, disminuyendo su movilidad. Adicionalmente el tejido cicatricial disminuye la nutrición por difusión del tejido nervioso, inhibe la regeneración y produce isquemia asociada a daño irreversible16.

Similar a Ozbay5, Ogut17 observó mejoramiento funcional significativo luego de la segunda y cuarta semana post operatoria en las ratas tratadas con terapia de ozono. Adicionalmente mediante evaluación bioquímica describe un aumento en la actividad de glutatión peroxidasa (GPx), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) en el grupo ozono con respecto al grupo control. Lo anterior se explica gracias a que el ozono, como un agente oxidante, permite generar un estrés oxidativo controlado. Este proceso es capaz de estimular respuestas antioxidantes adaptativas del tejido18 otorgando así una protección frente al estrés oxidativo derivado de la inflamación.

Ozbay5 destaca también, la significativa disminución de malondialdehído (MDA) en el grupo ozono frente al grupo control. Al haber una lesión nerviosa por aplastamiento, se produce una interrupción en la transmisión mecánica y en la microvascularización del nervio. Al generarse la reperfusión, se acumula oxígeno y nutrientes que favorecen la formación de radicales libres. Estos generan estrés oxidativo, que conduce a procesos nocivos para los tejidos como la peroxidación lipídica19,20. El MDA es un subproducto de este proceso, utilizado como marcador para evaluar el impacto de terapias antioxidantes21. Histológicamente Ozbay5 observó mayor cantidad de fibras células de Schwann en el grupo ozono en comparación al grupo control. Estas cumplen un rol importante en la regeneración nerviosa periférica, otorgando soporte y guía a los brotes axonales del extremo proximal22. Adicionalmente menciona mayor cantidad de fibras nerviosas mielinizadas y organelos citoplasmáticos en el grupo sometido a tratamiento con ozono. Por lo tanto, se observa que el ozono contribuye a la creación de un microambiente favorable para la regeneración nerviosa, capeando los efectos del estrés oxidativo sobre el tejido.

Dos de los siete estudios revisados complementaron la terapia de ozono con metilprednisolona, conocido agente inmunosupresor y antiinflamatorio23.

El uso de metilprednisolona como agente adyuvante se encuentra arraigado a evidencia relacionada a la supresión de la cascada inflamatoria en el sitio de la lesión, que ha demostrado ser beneficiosa para la regeneración de tejido nervioso24.

Ozturk, O. et al.25 describe en el grupo con tratamiento combinado, menor atrofia de células de Schwann con respecto al grupo intervenido exclusivamente con ozono, aspecto fundamental para la regeneración neuronal. Adicionalmente se describe un menor índice de degeneración neuronal en comparación al grupo control y al grupo tratado con ozono.

No obstante, se destaca una mayor formación de tejido granular perineural en el grupo sometido a tratamiento mixto en comparación al grupo tratado sólo con terapia de ozono. La formación y persistencia de este tejido puede ocasionar efectos no deseados a largo plazo como parestesia y debilidad muscular26. Sin embargo, el grupo tratado con ozono presentó índices considerablemente superiores de infiltración de células inflamatorias intraneurales y perineurales en comparación al grupo sometido a tratamiento combinado. Gürkan, G. et al.27 observó resultados similares con el tratamiento de ozono y metilprednisolona reportando una respuesta clínica superior y niveles de IL-6 considerablemente más bajos en el grupo tratado con la terapia combinada en comparación con el grupo tratado solo con ozono 7 días luego de las lesiones inducidas. Lo anterior puede atribuirse a las propiedades antiinflamatorias del fármaco28.

Gürkan, G. et al.27 menciona, además, niveles de estatus antioxidante totales (TAS) y estatus oxidante total (TOS). TAS y TOS son parámetros utilizados para reflejar el efecto antioxidante total y el efecto global de todos los oxidantes en plasma y en fluidos corporales respectivamente29. Se encontraron menores niveles de TOS en el grupo tratado exclusivamente con ozono comparado con el grupo tratado sólo con metilprednisolona, lo que indica que el ozono reduce el estrés oxidativo de una forma más eficiente que la metilprednisolona. El grupo con tratamiento combinado presentó los índices de TOS más bajos de todos los grupos. Asimismo, se observó en este grupo altos niveles de TAS, lo que sugiere un potenciamiento de las características antioxidantes del ozono30 atribuidas a la metilprednisolona.

Este estudio determinó también la superioridad antiinflamatoria de la metilprednisolona en comparación al ozono, sin embargo, se observó un aumento de estas características en el tratamiento en conjunto, mismo resultado que obtuvo Ozturk et al.25

El tratamiento combinado también arrojó una tasa de apoptosis menor en comparación a los grupos tratados exclusivamente con ozono y metilprednisolona, indicando un efecto celular protector superior.

Otros dos estudios compararon la terapia de ozono con terapias de laser de bajo nivel en términos de regeneración nerviosa. Estas últimas han demostrado capacidad de acelerar y promover el proceso regenerativo de nervios periféricos31.

Yucesoy10 observó un patrón de rehabilitación superior en los grupos tratados con ozono y fotobiomodulación que en el grupo control. Histológicamente destaca una mayor cantidad de células de Schwann en el extremo distal del nervio lesionado en el grupo tratado con terapia de ozono en comparación al grupo control, similar a lo descrito por Ozbay5 y Ozturk, O. et al. 25 Lo anterior sugiere que la terapia de ozono promueve un ambiente favorable para la mantención de la glía en el sitio de la lesión, lo que a su vez permitiría una regeneración más efectiva32.

Yuca33, por otra parte, difiere de lo descrito por Yucesoy10, mencionando que la terapia de laser de baja intensidad no otorgó resultados significativos frente al grupo control. Esto puede deberse a factores como el tiempo de aplicación y la longitud de onda del láser que pueden afectar considerablemente los resultados34.

Histológicamente describe un aumento considerable en el diámetro de las fibras nerviosas, área del nervio, número de ramificaciones y número de axones en el grupo tratado con ozono en comparación al grupo tratado con láser y control. Lo anterior nos sugiere que la terapia de ozono puede ser más eficiente que terapias laser de baja intensidad de 4 J de energía y una longitud de onda de 850 nm para el tratamiento de lesiones nerviosas y su regeneración.

En contraste con los estudios realizados por Ozturk25 y Gürkan27, los autores mencionan que optaron por aplicar ozono intraperitoneal y no una ozonización mediante solución salina debido a que la Federación Mundial de Ozonoterapia (WFOT) publicó una declaración, informando que «la ozonización de la solución salina» introduce una cantidad muy baja de eliminación de ozono en el cuerpo e induce la generación de peligrosos derivados de cloro oxidado, que han demostrado mutagenicidad y toxicidad en informes clínicos35.

Hassen36 evaluó las propiedades neuroprotectoras y neuroregenerativas de la terapia de ozono, encontrando que esta ofrecía protección frente al daño neuronal inducido por aspartamo, un agente altamente cancerígeno en dosis elevadas37. Histológicamente se observó mantención relativamente normal de la citoarquitectura loca, fascículos nerviosos y axones, tanto mielinizados como no mielinizados del nervio isquiático, observando mayor tinción de proteína básica de mielina (MBP) en el grupo tratado con ozono frente al grupo control. Se ha descrito que la MBP cumple un rol importante en mantener la estructura de la vaina de mielina y su compactación38 y es un marcador de células de Schwann utilizado comúnmente39. Adicionalmente el grupo tratado con ozono presentaba mayor índice de relación fibra/axón que el grupo tratado solo con aspartamo. Lo anterior sugiere que la terapia de ozono presenta propiedades neuroprotectoras sobre el tejido nervioso, vainas de mielina y células de Schwann del sitio de la lesión, contribuyendo así a la regeneración del tejido y a la preservación de su citoarquitectura funcional.

Niveles aumentados de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y angiopoyetina-1 fueron encontrados en el grupo tratado con ozono en comparación al grupo control y el tratado exclusivamente con aspartamo.  Un estudio demostró que la administración de genes exógenos codificantes para factor de crecimiento vascular endotelial contribuía a mejorar la función nerviosa en modelos in vivo40 y se ha demostrado que la revascularización derivada de la activación de la cascada VEGF-VEGFR es esencial para la regeneración nerviosa periférica41. Esto sugiere que la administración de terapia de ozono contribuye a la estimulación de vías que promueven la revascularización y preservación del tejido, con un impacto positivo en la regeneración.

Niveles de netrina y ninjurina también se encontraron aumentados en el grupo tratado con terapia de ozono con respecto al control y al grupo aspartamo. Según estudios recientes, la netrina juega un rol positivo en la promoción de la regeneración de tejido nervioso periférico y en la proliferación y migración de células de Schwann42. La ninjurina es un factor que contribuye a la neurogénesis bajo condiciones fisiopatológicas y cumple un rol importante en el proceso regenerativo de los nervios periféricos, particularmente en el proceso de mielinización43.

Se describe también una cantidad aumentada de factor neurotrópico derivado de cerebro (BDNF) y factor neurotrópico derivado de célula glial (GDNF) en el grupo tratado con ozono.

El BDNF promueve el crecimiento y regeneración de neuritas y constituye uno de los objetivos de terapéuticos de diversos tratamientos pro-neuroregenerativos44. Si bien BDNF y el GDNF han demostrado capacidades neuroregenerativas individuales, su efecto es mucho mayor en conjunto, promoviendo regeneración y proliferación de brotes axonales, contribuyendo a mantener la citoarquitectura local45. Lo anterior suscita una clara respuesta regenerativa y protectora del tejido, estimulada y favorecida por la terapia de ozono.

Si bien la evidencia relacionada a la efectividad del tratamiento de ozono en esta área es escaza y fue la principal limitación de nuestro estudio, la que se obtuvo nos entrega resultados positivos al respecto en cuanto a su uso no invasivo con fines terapéuticos. Los siete estudios incluidos entregaron resultados que denotan la eficacia de la terapia de ozono en términos de regeneración protección nerviosa en modelos animales con respecto a grupos control. Se sugiere por lo tanto realizar más estudios al respecto para ampliar y complementar el conocimiento disponible, utilizando métodos bioquímicos, inmunohistoquímicos y de microscopia electrónica de ser posible.

Actualmente el procedimiento sólo se ha realizado en ratones, por lo que la viabilidad de su realización y administración en humanos es un campo que queda por explorar. Sin embargo, se postula que el tratamiento con ozono puede ser un tratamiento alternativo seguro y efectivo para el daño nervioso, debido a sus efectos sobre el metabolismo del oxígeno, la energía celular y los mecanismos de defensa antioxidante expuestos por Ozbay5.

Debido a esto, se sugiere evaluar y estudiar la realización de una terapia en un corto plazo después de ocurrida la lesión, con administración in situ18, considerando que concentraciones de ozono superiores a 50 ug/ml podrían causar dolor o lesiones graves en el nervio periférico17. De esta manera, el ozono promueve la generación de agentes antioxidantes y síntesis de proteínas que disminuyen el estrés oxidativo favoreciendo la creación de un microambiente apropiado para el proceso de neuroregeneración y protección celular.

Para estudios posteriores sugerimos que se realicen con tiempos de seguimiento más prolongados. Asimismo, y considerando la sinergia del ozono con la metilprednisolona en los estudios de Ozturk, O. et al.25    y Gürkan, G. et al.27, se recomienda evaluar la terapia de ozono complementada con otros compuestos y/o fármacos que hayan demostrado efectividad neuroregenerativa y neuroprotectora, tales como la genisteína, gabapentina, zofenopril y dexametasona13,24,46. Adicionalmente se sugiere realizar estudios comparativos con tratamientos alternativos, como terapias de laser de bajo nivel, para dilucidar la efectividad comparada y contribuir a la estandarización de los protocolos y parámetros de tratamiento y administración.

CONCLUSIÓN

Los datos recolectados sugieren que la terapia con ozono podría ser una opción viable y beneficiosa en la regeneración nerviosa en comparación a grupos control, sobre todo si es aplicada en estadios tempranos de la lesión, idealmente antes de que ocurra el restablecimiento de la microvascularización para minimizar el daño nervioso por estrés oxidativo. No aconsejando su administración por medio de solución salina o en dosis superiores a 50 ug/ml.

A pesar de que se ha comprobado el efecto antiinflamatorio del ozono, este es mucho menor en comparación a fármacos como la Metilprednisolona. Sin embargo, ambos se sinergizan añadiendo el beneficio del ozono contra el estrés oxidativo, brindando un ambiente favorable para la regeneración del nervio clínica e histológicamente. Sin embargo, se sugiere realizar más estudios al respecto que contengan evaluaciones funcionales e histopatológicas con periodos de seguimiento más prolongados.

 

 

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